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免疫組化染色過程中存在的五大問題以及解決方案！

時間：2023-03-29 15:06

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一、固定不充分

10%中性福爾馬林是目前應(yīng)用最廣泛且效果較好的固定方式。組織塊太大，或固定時間太短，都會導(dǎo)致固定不充分。一般8-24h為宜，具體還需要經(jīng)過實際操作摸索確定。如圖1的這種情況，可適當(dāng)延長固定時間到48h。

圖1 固定不充分

二、內(nèi)源性過氧化物酶

彌散性非特異性背景，可能是由內(nèi)源性過氧化物酶引起的（如圖2）。因此，封閉液要現(xiàn)配現(xiàn)用，充分封閉，一般15min。

圖2 內(nèi)源性過氧化物酶引起非特異背景

三、染料斑點

片子出現(xiàn)染料斑點（如圖3），可能是因為染料放置時間太長，可以嘗試過濾染料；或者洗滌時不充分，殘渣沒有洗掉。

圖3 染料斑點

四、邊緣效應(yīng)

干片的原因有動作太慢、忘記滴液、滴液流失等，造成非特異性染色，即“邊緣效應(yīng)”（如圖4）。采用DAKO筆或PAP Pen在距離組織邊緣3-4 mm處畫圈，可達到有效的避免液體流失、提高操作速度的效果。

另外，向清洗緩沖液中加入吐溫20（Tween-20）也是一種防止干片的好方法。500ml PBS磷酸鹽緩沖液，加入2～3滴Tween-20即可。

圖4 邊緣效應(yīng)

五、染色不均勻

染色不均勻可能是因為臺面傾斜，兩邊液體不均，液體少的一邊，顏色較淺，液體多的一邊，顏色較深；也可能是因為抗原修復(fù)后，熱修復(fù)液未冷卻，立即取出了片子。

圖5 染色不均勻